日俄战争结束后，日本统治者又于1907年在沙俄监狱的基础上，将牢房扩建到253间，设暗牢4间，病牢若干间，15座厂房，占面积22.6万平方米。这座当时在东北地区较大的法西斯监狱，是由日本驻“满洲国”大使直接控制的，并曾几易其名。初称“关东都督府监狱署于”，1920年改为“关东厅监狱”，1934年又叫“关东刑务所”，1939年称为“旅顺刑务所”。这里同时可关押2000多人，当年有许多爱国志士和共产党员及大批无辜百姓，都在这里惨遭酷刑与折磨。其中大多数为中国人，也有反战的日本人与朝鲜人。

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1941年太平洋战争爆发后，日本侵略者更是疯狂逮捕抗日志士和爱国同胞，从东北、华北等地用专车押运到此地囚禁，监狱占地面积22.6万平方米，是当时东亚地区最大的法西斯监狱，因此被称为东方的“奥斯维辛”。究竟有多少人在此被害，已经无法估计。从1942年到1945年，仅在绞刑室遇难的就有700多人。

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1945年日本投降前夕，日本刽子手在狱内疯狂进行秘密大屠杀，并销毁了所有的档案材料及各种罪证。自1971年起，当地文化部门根据广大群众要求，组织人力开展社会调查，并搜集和整理了大批历史文物和照片资料，利用监狱现场举办“帝国主义侵华罪行展览”。1987年，又在狱内原纺织工厂开辟了“日俄侵略旅大地区罪证文物特展”室，展出了自1894年甲午战争至1945年沙俄、日本侵占旅顺地区期间的罪行照片、图表、碑石、实物200余件。

旅顺日俄监狱是由沙俄和日本两个帝国主义国家先后建造的监狱，是帝国主义列强侵华和反人类的铁证，其野蛮和残忍程度在世界上是罕见的。